导读：PROTAC 分子能否有效诱导靶蛋白降解，并不只取决于靶点配体或 E3 配体各自的二元亲和力。Roy 等发表于 ACS Chemical Biology 的研究以 BET 溴结构域蛋白和 VHL 招募型 PROTAC 为体系，建立了基于表面等离子共振（SPR）的三元复合物动力学测定方法，直接观察靶蛋白、PROTAC 与 E3 连接酶之间复合物的形成和解离，并把体外解离动力学与细胞内降解速率联系起来。

研究背景

PROTAC 的作用机制依赖一个关键中间体：靶蛋白、双功能小分子与 E3 连接酶形成三元复合物。该复合物为靶蛋白泛素化提供空间邻近性，随后经泛素-蛋白酶体系统实现蛋白水平降低。因此，降解剂设计不能简单等同于“靶点抑制剂加 E3 配体”的拼接。靶点配体亲和力、E3 配体亲和力、连接链长度与构象、诱导蛋白-蛋白相互作用、三元复合物稳定性和解离速率，都可能影响降解结果。

在药物化学优化中，传统二元结合数据仍然重要，但对 PROTAC 而言，二元亲和力只能描述分子与单一结合伙伴的相互作用，难以解释为什么某些分子在靶点结合相近的情况下，细胞降解活性差异明显。三元复合物既包含小分子与两端蛋白的结合，也包含靶蛋白与 E3 连接酶之间被诱导出的新界面；这些界面的有利或不利相互作用，常以协同性和复合物寿命表现出来。Roy 等工作的切入点，正是把这一中间体作为可定量对象。

核心内容

该研究题为“SPR-Measured Dissociation Kinetics of PROTAC Ternary Complexes Influence Target Degradation Rate”，由 Roy、Winkler、Hughes、Whitworth、Galant、Farnaby、Rumpel 与 Ciulli 等完成。论文围绕 BET 家族溴结构域蛋白 Brd2、Brd3、Brd4 的 BD2 结构域，以及 von Hippel-Lindau（VHL）E3 连接酶招募体系，比较了一组靶向 BET 的 PROTAC 分子诱导三元复合物形成与解离的能力。

关键分子包括已用于研究 BET 降解的 MZ1，以及同一研究框架下用于比较的其他 BET 靶向 PROTAC。靶蛋白端为 BET 蛋白的溴结构域，E3 端为 VHL 体系。实验体系首先以纯化蛋白建立体外 SPR 测定，随后把复合物动力学参数与细胞内 Brd2、Brd3、Brd4 降解表现进行对应分析。研究重点不是证明 PROTAC 能形成三元复合物这一概念，而是定量三元复合物形成、解离及其寿命差异，并考察这些差异是否可解释降解速率。

从结果看，MZ1 诱导 Brd4 BD2 或 Brd2 BD2 与 VHL 形成的三元复合物更稳定，解离更慢；而与 Brd3 BD2 形成的相应复合物稳定性较低。论文指出，Brd3 BD2 与其他 BET BD2 之间一个氨基酸差异会影响复合物界面，从而削弱三元复合物寿命。细胞实验中，Brd2 和 Brd4 的初始降解速率高于 Brd3，与体外 SPR 测得的三元复合物解离半衰期差异相一致。

机制与证据

该 SPR 方法的核心价值在于以实时、无标记方式读取结合过程。研究并非只测一个终点亲和力，而是观察三元复合物形成和解离的动力学曲线，得到结合速率、解离速率和表观稳定性等参数。对于 PROTAC 而言，解离速率尤其具有机制意义：若三元复合物停留时间过短，E3 连接酶与靶蛋白的有效接触窗口可能不足，泛素化效率与降解速率就可能受限；若复合物寿命更长，则更有机会完成有利的泛素转移过程。

研究用 BET BD2 蛋白与 VHL 体系作为模型，有利于把问题聚焦到三元复合物界面。BET 家族成员同源性高，Brd2、Brd3、Brd4 的 BD2 结构域在二元配体识别上具有可比性，但 PROTAC 诱导的三元复合物并不完全等同。MZ1 对 Brd2 BD2 和 Brd4 BD2 形成较长寿命复合物，提示靶蛋白表面与 VHL 之间被诱导出的蛋白-蛋白相互作用具有正向贡献；Brd3 BD2 中界面差异则削弱了这种贡献。该发现说明，同一家族靶点的选择性不仅来自靶点配体本身，也可能来自三元复合物界面。

论文还比较了正协同与负协同情形。正协同意味着三元复合物相较于两个二元结合事件更稳定，靶蛋白与 E3 连接酶在 PROTAC 桥接下形成额外有利相互作用；负协同则提示三方结合中存在构象或界面上的不利因素。对于药物化学优化，这一信息比单纯二元 KD 更接近降解机制，因为 PROTAC 的功能性中间体并不是二元复合物，而是能够促成泛素化的三元复合物。

细胞证据为体外动力学提供了功能关联。研究观察到，不同 BET 蛋白在细胞内的初始降解速率存在差异，而这一差异与 SPR 测得的三元复合物解离半衰期相呼应。换言之，较长寿命的 Brd2/Brd4 三元复合物对应更快的初始降解，较短寿命的 Brd3 复合物对应较慢降解。这里的证据链由纯化蛋白生物物理测定、同源靶点比较、关键界面差异和细胞降解结果共同构成，支持“复合物寿命影响降解速率”的判断。

为什么值得关注

这项工作为 PROTAC 优化提供了一个清晰信号：二元亲和力不是唯一目标，三元复合物动力学应当成为设计参数。对传统小分子抑制剂而言，提高靶点亲和力常常是优化主线；而对 PROTAC 而言，过度强调某一端结合能力可能仍不足以带来理想降解。连接链如何摆放两端蛋白、是否诱导有利蛋白-蛋白界面、复合物能维持多长时间，都会影响泛素化机会和降解效率。

该研究也有助于解释 BET 家族内选择性。Brd2、Brd3、Brd4 同属 BET 蛋白，传统抑制剂常面临家族选择性困难。PROTAC 通过引入 E3 连接酶界面，使选择性来源从“配体识别口袋”扩展到“靶蛋白-PROTAC-E3 三方构象”。一个细微氨基酸差异即可影响三元复合物寿命和细胞降解速率，提示降解剂可能利用蛋白表面差异实现同源蛋白间的功能区分。

从产业和平台角度看，SPR 动力学测定提供了可用于早期筛选和机制拆解的工具。候选 PROTAC 分子常具有较大分子量、构象柔性和复杂作用机制，仅凭细胞降解曲线很难判断失败原因。若把二元亲和力、三元复合物亲和力、协同性、解离速率和细胞降解速率并行比较，药物化学团队可以更有针对性地调整连接链、连接位点和配体组合，而不是仅在终点降解百分比上进行经验迭代。

更重要的是，该论文把“降解速率”与“复合物解离半衰期”放在同一个机制框架中讨论。降解不是静态占有，而是需要完成三元复合物形成、泛素转移、蛋白酶体识别和靶蛋白消除的一系列过程。三元复合物若停留时间更长，可能提高有效泛素化概率；若停留时间过短，即使短暂形成复合物，也未必形成高效降解。由此，动力学参数成为 PROTAC 设计中具有解释力的指标。

边界与待验证问题

该研究的边界同样需要明确。首先，论文主要以 BET BD2 与 VHL 招募型 PROTAC 为模型，所得规律对其他靶点、其他 E3 连接酶和不同细胞背景的适用性仍需在各自体系中验证。三元复合物寿命与降解速率之间存在相关性，但不同靶蛋白的赖氨酸分布、可及性、细胞定位、蛋白周转速度和 E3 表达水平，均可能改变降解结果。

其次，SPR 是体外纯化蛋白体系，能够提供清晰的结合动力学读数，但不能完全代表细胞内环境。细胞中存在蛋白复合物、翻译后修饰、亚细胞定位、膜通透性、外排、代谢稳定性和游离药物浓度等因素。一个体外三元复合物稳定的分子，仍可能因细胞暴露不足或定位不匹配而无法形成理想降解；相反，细胞内高局部浓度或特定蛋白环境也可能改变体外预测。

再次，三元复合物过于稳定是否总是有利，也不能简单化。PROTAC 被期望具备催化式周转能力，即分子诱导一个靶蛋白降解后可以继续参与下一轮作用。若复合物稳定性与解离速率达到某种不利平衡，可能影响周转效率。该论文强调较长寿命复合物与更快初始降解之间的联系，但药物化学优化仍需在稳定性、周转、细胞暴露和选择性之间取得平衡。

最后，该方法建立了可量化框架，但不应替代细胞与功能实验。SPR 数据适合解释和指导设计，细胞内靶蛋白降解、下游通路响应、增殖或表型效应、选择性谱和毒性窗口仍是判断降解剂价值的重要依据。对 PROTAC 项目而言，较合理的策略是把 SPR 三元复合物动力学作为早期机制筛选模块，与蛋白质组学、细胞药理和构效关系研究共同使用。

参考信息

来源：Roy et al., “SPR-Measured Dissociation Kinetics of PROTAC Ternary Complexes Influence Target Degradation Rate”, ACS Chemical Biology, 2019；PubMed URL：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30721025/