导读：2021-02-10，Nature Communications 发表题为 Mutant-selective degradation by BRAF-targeting PROTACs 的研究，报道了一类基于 vemurafenib 等 BRAF 结合单元设计的 PROTAC，可在多种 BRAF 突变背景中实现低纳摩尔级蛋白降解，同时相对保留静息构象下的野生型 RAF 家族蛋白。对于靶向蛋白降解领域而言，这项工作的重要性不只在于把 BRAF 从“抑制”推进到“降解”的药理学框架，更在于提示降解选择性并不完全由二元结合亲和力决定，靶蛋白构象、细胞内激活状态以及 E3 招募几何关系，均可能成为药物化学优化中的关键变量。
研究背景
BRAF 是 RAS-RAF-MEK-ERK 信号轴中的核心激酶之一，其突变可驱动多种肿瘤相关信号。传统 BRAF 小分子抑制剂的设计逻辑主要围绕激酶口袋占位与信号通路抑制展开，尤其集中在部分高活性突变背景。然而，BRAF 突变类型并不单一，不同类别突变在单体信号、二聚体信号、激酶活性强弱以及对上游 RAS 依赖性方面存在差异。对药物研发而言，同一个“BRAF 靶点”背后实际对应的是多种构象状态和信号依赖关系。
PROTAC 的切入点与抑制剂不同。它并不只要求持续占据催化位点，而是通过连接靶蛋白结合单元与 E3 连接酶配体，诱导靶蛋白、PROTAC、E3 连接酶之间形成三元复合物，从而促使靶蛋白泛素化并经蛋白酶体降解。理论上，这种方式有机会同时消除激酶活性功能和非催化支架功能，因此对具有复杂信号作用的 RAF 家族蛋白具有研究价值。
本论文选择以 BRAF 为模型，探索一个关键问题：如果使用 BRAF 抑制剂衍生的结合单元来构建 PROTAC，能否在不同 BRAF 突变体之间实现有效降解，并在野生型 RAF 家族蛋白上保留足够选择性。这个问题对药物化学读者尤其重要，因为它直接关系到“抑制剂选择性”能否转化为“降解剂选择性”，以及 linker、E3 招募和靶蛋白构象是否能提供额外选择性窗口。
核心内容
研究团队基于 vemurafenib 相关 BRAF 结合单元构建 BRAF 靶向 PROTAC，并通过优化 linker 与 VHL 招募模块得到代表性分子 SJF-0628。该分子由 BRAF 结合端、连接臂和 VHL 配体组成；研究中还设计了不能有效招募 VHL 的表异构体对照，用于区分单纯靶点结合与真正 PROTAC 介导降解之间的差异。
在表达不同 BRAF 构建体的细胞模型中，SJF-0628 能剂量依赖性降低多类 BRAF 突变体蛋白水平，并相对保留 BRAF 野生型、ARAF 和 CRAF。进一步在内源性突变 BRAF 癌细胞中，研究观察到低纳摩尔级 DC50 与较高 Dmax。例如在 BRAF V600E 背景的细胞中，论文报告了接近完全的 BRAF 降解，并伴随 MEK、ERK 磷酸化信号下降；在部分二类和三类 BRAF 突变背景中，也观察到 BRAF 蛋白水平下降和通路信号变化。
这一结果的核心信息在于，父本抑制剂与 PROTAC 的药理轮廓并不完全等同。vemurafenib 的使用经验更多建立在特定突变背景下的激酶抑制，而本研究中的 PROTAC 则利用同类结合单元，将作用模式扩展为蛋白清除。对 BRAF 这类兼具催化功能与信号支架功能的靶点而言，降解剂带来的不是简单的“更强抑制”，而是靶蛋白层面的重新干预。
机制与证据
论文最值得关注的部分，是对突变选择性来源的机制拆解。一般直觉会认为，如果一个 PROTAC 能选择性降解突变 BRAF，原因可能是它对突变体的二元结合更强。但研究结果显示，二元结合并不能充分解释现象。SJF-0628 在生化体系中可有效作用于 BRAF 野生型与突变体，说明单纯的靶点占位并不是降解选择性的唯一决定因素。
研究团队随后把问题转向三元复合物形成。纯化蛋白体系中的结果并不能完全复制细胞内情况；在细胞裂解液和细胞内检测中，突变 BRAF 更有利于与 PROTAC 和 VHL 形成有效复合物，而野生型 BRAF 在静息状态下更倾向于处于不利于三元复合物形成的构象。换言之，BRAF 野生型并非不能被结合，而是在细胞环境中的构象与复合物组织方式使其较难进入高效泛素化路径。
这一点通过激活状态实验得到支持。论文显示，当上游信号使野生型 BRAF 更趋向开放或激活状态时，其对 PROTAC 诱导降解的敏感性会增加；反过来，抑制上游信号可降低野生型 BRAF 的降解倾向。这个观察使研究从“某个分子是否有效”推进到“细胞内蛋白状态如何决定降解命运”的层面，也解释了为什么同样的结合单元在抑制剂和降解剂语境下会呈现不同选择性。
研究还使用蛋白酶体抑制、neddylation 抑制和过量竞争性 BRAF 结合配体等方式验证降解机制。突变 BRAF 蛋白下降可被这些处理阻断，支持其符合 PROTAC 介导的泛素-蛋白酶体降解逻辑，而非单纯转录下调或抗体检测假象。对照分子保留 BRAF 结合端但失去有效 E3 招募能力，不能产生同等蛋白清除效果，也进一步强调 E3 招募是药效机制的必要环节。
为什么值得关注
第一，这项研究把 BRAF 这一经典激酶靶点放入了靶向蛋白降解框架。激酶抑制剂开发长期强调 ATP 口袋、变构口袋、选择性和耐药突变，而 PROTAC 增加了新的设计维度：不只是“能否结合”，还要看结合后能否形成空间上可泛素化的复合物。对于药物化学团队而言，这意味着 SAR 不再只围绕 IC50 或结合亲和力展开，还需要同时考虑 linker 出口、E3 配体、靶蛋白表面赖氨酸可及性和细胞内构象群体。
第二，论文展示了降解剂选择性可以来自细胞内状态差异。BRAF 野生型在静息构象下相对保留，而突变体因激活状态、二聚化或信号复合物差异，更容易形成可导致泛素化的三元复合物。这种选择性不是传统意义上的“突变口袋选择性”，而是一种由构象和复合物几何关系共同塑造的功能性选择性。
第三，该研究对 BD 和投融资读者也有启发。BRAF 是已被充分验证的肿瘤信号靶点，但不同突变类别和耐药机制给传统抑制剂带来挑战。降解策略提供了一种不同于激酶活性抑制的干预方式，尤其对保留支架功能、二聚体信号或激酶活性较弱但仍具信号作用的突变蛋白具有理论吸引力。不过，这种吸引力应被理解为早期研究价值，而不是临床疗效结论。
第四，论文对整个 PROTAC 领域提出了方法学提醒。许多早期项目会从高亲和力配体出发，快速连接 E3 配体并筛选降解活性；但这项工作显示，细胞内三元复合物检测可能比纯化蛋白体系更接近真实降解结果。对于复杂构象靶点，单纯依赖体外结合数据可能低估或误判降解选择性。
边界与待验证问题
需要强调的是，这篇论文仍属于机制与转化前研究范畴，不能写成已经进入临床，也不能写成已经证明患者治疗获益。文中涉及的细胞和动物模型结果可支持 BRAF 靶向 PROTAC 的可行性，但距离候选药物筛选、系统毒理、给药窗口、药代暴露和临床适应症验证仍有多项问题需要解决。
一是分子性质问题。PROTAC 通常具有较高分子量和复杂理化性质，能否在保持降解选择性的同时获得理想细胞通透性、组织暴露、代谢稳定性和给药便利性，是从工具分子走向药物候选物必须面对的难点。论文中的代表性分子证明了机制可行性，但不等于具备完整成药属性。
二是 RAF 家族信号的安全边界。RAF-MEK-ERK 轴存在反馈调节和旁路激活，BRAF、CRAF、ARAF 之间也存在二聚化和互作。即使野生型 RAF 在某些静息条件下相对保留，在上游信号活跃的细胞环境中，野生型 BRAF 对降解的敏感性也可能变化。因此，选择性需要在更多细胞背景、肿瘤依赖关系和正常组织相关模型中继续验证。
三是患者分层与突变类别问题。BRAF 突变并不是单一生物学实体，不同突变类别对 RAF 二聚体、RAS 依赖性和 MEK-ERK 输出的贡献不同。降解剂能否为某一类突变带来更优治疗窗口，需要依赖更系统的模型验证，而不能由单一细胞系或单一突变外推到全部 BRAF 改变。
四是 E3 选择与几何优化问题。本研究使用 VHL 招募策略获得了突变选择性，但并不意味着 VHL 是所有 BRAF 降解剂设计的唯一或最优选择。不同 E3 连接酶在组织表达、亚细胞定位、复合物方向和泛素化效率上可能不同，未来的药物化学优化需要在 linker、E3 配体和靶蛋白构象之间寻找更稳定的窗口。
总体而言，这篇研究的价值在于把 BRAF 降解从概念推进到较系统的机制验证，并用具体实验说明：PROTAC 的突变选择性可以来自靶蛋白在细胞内的构象与激活状态，而不仅是结合口袋本身。对靶向蛋白降解领域来说，这是理解“为什么某些蛋白被降解、某些蛋白被保留”的重要案例。
