导读：2019年6月17日，Nature Chemical Biology 在线发表 Harnessing the anti-cancer natural product nimbolide for targeted protein degradation。研究从天然产物 Nimbolide 的抗癌活性出发，利用 ABPP 化学蛋白质组学发现其可作用于 E3 泛素连接酶 RNF114，并进一步证明该天然产物骨架可被用于招募 RNF114，构建靶向蛋白降解分子。

研究背景

靶向蛋白降解的核心在于将目标蛋白与细胞内泛素-蛋白酶体系统连接起来。典型异双功能降解剂由目标蛋白配体、连接臂和 E3 连接酶招募配体组成，通过诱导目标蛋白与 E3 连接酶形成近邻关系，使目标蛋白发生泛素化并被蛋白酶体降解。对药物化学而言，E3 配体的数量和性质直接决定了降解剂设计空间。

在该研究发表时，可用于降解剂设计的 E3 招募体系仍相对有限。CRBN、VHL、MDM2、IAP 等体系已经为该领域提供了重要范例，但人体内 E3 连接酶数量众多，真正具有可用小分子招募配体的 E3 仍只是少数。因而，发现新的 E3 招募化学起点，是扩展靶向蛋白降解适用范围的重要方向。

Nimbolide 是来源于 Neem tree 的萜类天然产物，已有研究提示其具有抑制癌细胞表型的活性，但直接作用靶点和分子机制并不清楚。该论文的切入点并非简单把 Nimbolide 作为传统细胞毒或抗增殖分子处理，而是追问其共价反应性是否能够揭示新的可药性位点，并由此转化为蛋白降解工具。

核心内容

论文首先利用 activity-based protein profiling（ABPP）相关化学蛋白质组学方法，在乳腺癌细胞体系中解析 Nimbolide 的潜在反应蛋白。结果显示，RNF114 是 Nimbolide 的一个重要功能靶点，关键反应位点位于 RNF114 上的 C8。RNF114 属于 E3 泛素连接酶，其生物学功能与底物识别和底物泛素化密切相关。

研究进一步显示，Nimbolide 并不是通过简单抑制泛素系统整体活性来影响细胞，而是可破坏 RNF114 对底物的识别。RNF114 底物识别受扰后，p21 等肿瘤抑制蛋白的泛素化和降解受到抑制，导致这些蛋白快速稳定。由此，Nimbolide 对乳腺癌细胞增殖的抑制，至少部分来自 RNF114-底物识别轴被打断。

更关键的是，作者将这一发现进一步转化为降解剂设计。研究构建了以 Nimbolide 作为 RNF114 招募模块、以 JQ1 作为 BRD4 结合模块的双功能分子 XH2。该分子把 RNF114 引导至 BRD4 附近，促使 BRD4 在细胞中发生降解，从而证明 Nimbolide 不仅可作为 RNF114 的功能探针，也可作为 RNF114 招募配体用于靶向蛋白降解应用。

这一设计使天然产物共价化学与 PROTAC/异双功能降解剂逻辑发生连接：Nimbolide 负责 E3 招募，JQ1 负责识别 BET 家族蛋白中的 BRD4，连接臂负责调节两端空间关系。研究通过这种组合展示了 RNF114 可被纳入可设计的降解系统之中。

机制与证据

在机制层面，论文提供了几类相互支撑的证据。第一，isoTOP-ABPP 等化学蛋白质组学结果将 RNF114 的 C8 标记为 Nimbolide 作用的重要位点。作者还通过 Nimbolide 探针、竞争标记实验以及 C8A 突变等方式，支持 Nimbolide 与 RNF114 C8 发生共价作用的结论。

第二，细胞功能实验显示，RNF114 干扰会影响乳腺癌细胞增殖，并削弱 Nimbolide 的部分作用。该结果提示 RNF114 不只是一个被化学标记到的蛋白，而是 Nimbolide 抗增殖表型中的功能相关靶点。研究中使用的 231MFP 乳腺癌细胞模型，为解析 Nimbolide 与 RNF114 之间的功能关系提供了细胞背景。

第三，底物层面的证据显示，Nimbolide 可干扰 RNF114 与 p21 的相互作用，进而抑制 p21 泛素化和降解，使 p21 水平升高。文中还关注 p57 等相关底物或候选底物，说明 RNF114 介导的底物识别可能牵涉更广泛的细胞周期和增殖调控网络，但核心结论仍集中在 Nimbolide-RNF114-p21 轴。

第四，降解剂验证环节围绕 XH2 展开。XH2 被设计为 Nimbolide-JQ1 型双功能分子，可在 231MFP 细胞中诱导 BRD4 蛋白下降。蛋白酶体抑制剂 bortezomib 和 E1 泛素活化酶抑制剂 TAK-243 可阻断相关降解信号，支持该过程依赖泛素-蛋白酶体系统。RNF114 野生型与敲除 HAP1 细胞的比较进一步显示，XH2 诱导的 BRD4 降解与 RNF114 相关。

第五，定量蛋白质组学用于观察 XH2 处理后的蛋白变化。该类数据有助于判断降解事件是否具有一定选择性，并把单一 Western blot 证据扩展到蛋白组层面。对降解剂设计而言，能否在全蛋白组背景下优先降低预期靶蛋白，是评估双功能分子是否具备可优化价值的重要指标。

为什么值得关注

该研究的价值首先在于扩展 E3 配体来源。传统降解剂开发常依赖少数已有 E3 招募配体，而该论文显示，天然产物的共价反应性可以成为发现 E3 可药性位点的入口。Nimbolide 通过作用于 RNF114 的底物识别相关区域，为 RNF114 招募提供了化学起点。

其次，论文把“天然产物靶点发现”和“靶向蛋白降解设计”连接在同一条研究链条中。ABPP 不是仅用于解释天然产物抗癌表型，还被用来发现可转化为降解剂模块的 E3 作用位点。这对化学生物学读者尤其重要：活性天然产物并不只是一类难以优化的复杂分子，也可能为新的降解系统提供结构启发。

第三，RNF114 作为 E3 连接酶被引入降解剂设计，为 E3 选择提供了不同于 CRBN 和 VHL 的可能性。不同 E3 在组织表达、亚细胞定位、底物偏好和复合物构象方面均可能影响降解效率。扩充 E3 组合，有助于应对某些靶点在既有 E3 体系中难以形成有效降解复合物的问题。

第四，该研究强调共价化学在 E3 招募中的双重性。Nimbolide 对 RNF114 的作用一方面扰动其天然底物识别，造成 p21 等蛋白稳定；另一方面，经过双功能化改造后，该共价作用又可被利用为人工招募模式，使 RNF114 靠近 BRD4 并促成 BRD4 降解。相同化学反应位点在不同分子设计中可以产生不同功能输出。

第五，XH2 的案例说明，降解剂设计并不只看二元结合亲和力。连接臂长度、连接位点、E3 与目标蛋白的空间取向、泛素转移可及性，以及是否形成有利的瞬时复合物，都会决定目标蛋白能否被有效降解。Nimbolide-RNF114 体系为这些问题提供了新的实验平台。

边界与待验证问题

该研究仍应被理解为临床前化学生物学工作。Nimbolide 本身具有多靶点可能性，论文也提示 Nimbolide 探针可富集除 RNF114 之外的其他蛋白。因此，RNF114 是一个重要功能靶点，并不等于 Nimbolide 的全部细胞效应都可由 RNF114 单独解释。

RNF114 相关降解剂也仍处于工具分子验证阶段。XH2 证明了 Nimbolide 可作为 RNF114 招募模块诱导 BRD4 降解，但其药代性质、体内暴露、组织分布、脱靶反应、共价选择性和安全窗口均未构成药物开发结论。天然产物骨架结构复杂，合成与结构优化难度也需要被纳入进一步药物化学考量之外的当日边界中。

共价 E3 招募还需要特别关注反应选择性。若分子在细胞内标记过多蛋白，可能带来解释复杂性和毒性风险；若共价反应过弱，则可能无法维持足够 E3 招募；若反应过强，又可能影响 E3 周转或改变其天然底物谱。该研究以 C8 为关键位点建立了概念证明，但选择性、可调性和可迁移性仍需要更多结构-活性关系数据支持。

此外，RNF114 的天然生物学功能本身也值得谨慎处理。Nimbolide 扰动 RNF114 后可稳定 p21 等肿瘤抑制蛋白，这一效应在乳腺癌细胞模型中具有解释力，但不同细胞类型、不同 RNF114 底物背景和不同靶蛋白降解任务中，效果可能不同。把 RNF114 招募用于更广泛靶点之前，需要逐一验证降解依赖性、细胞背景依赖性和蛋白组选择性。

总体而言，该论文的贡献不在于给出成熟药物候选物，而在于展示了一条清晰路径：用化学蛋白质组学识别天然产物作用位点，再把该位点转化为 E3 招募逻辑，并通过双功能分子完成靶蛋白降解验证。对 PROTAC 与靶向蛋白降解领域而言，这是一次关于 E3 配体发现方式的重要拓展。

参考信息

来源标题：Harnessing the anti-cancer natural product nimbolide for targeted protein degradation；期刊：Nature Chemical Biology；公开来源：PMC；URL：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6592714/