导读：2021-09-14，JACS 在线发表 Harnessing the E3 Ligase KEAP1 for Targeted Protein Degradation，报道将 KEAP1 开发为 PROTAC E3 连接酶招募系统的概念验证。研究以高选择性、非共价 KEAP1 小分子结合物为招募端，连接 BET 蛋白结合端，证明 KEAP1 可被用于诱导细胞内靶蛋白降解。对于仍高度依赖 CRBN、VHL、IAP、MDM2 等少数 E3 的 PROTAC 领域而言，这项工作的重要性不在于立即给出通用答案，而在于提供了一个新的、具备明确生物学基础和化学可设计性的 E3 招募入口。
研究背景
PROTAC 的核心逻辑是用双功能小分子把目标蛋白与 E3 泛素连接酶拉近，从而触发目标蛋白泛素化并经蛋白酶体降解。与传统抑制剂相比，PROTAC 更强调事件驱动的药理学：只要化合物能够在细胞内形成有效三元复合物，并把目标蛋白呈递给合适的 E3，便可能实现对蛋白水平的直接下调。这一机制为处理非酶活性功能、支架蛋白功能以及难以通过活性位点抑制的靶点提供了新的药物化学空间。
不过，E3 招募端一直是 PROTAC 设计中的瓶颈之一。人类细胞内存在大量 E3 连接酶或 E3 复合体组分，但真正拥有可用于细胞实验和小分子降解剂构建的配体工具者并不多。CRBN、VHL、IAP 和 MDM2 等系统为早期 PROTAC 研究提供了关键支撑，也形成了相对成熟的连接子、三元复合物和细胞药效经验。然而，过度依赖少数 E3 会限制组织选择性、细胞背景适配、靶点谱覆盖以及耐受性窗口的探索。
KEAP1，即 Kelch-like ECH-associated protein 1，是细胞氧化应激应答通路中的重要蛋白。它作为 CUL3-RBX1 型 E3 泛素连接酶复合体的底物适配蛋白，经典功能是识别并调控 NRF2。正常状态下，KEAP1 结合 NRF2 并促进其泛素化降解；当细胞受到氧化或亲电压力时，KEAP1 的应激感知状态发生改变，NRF2 稳定并启动抗氧化相关转录程序。正因为 KEAP1 具有清晰的底物识别结构域、生物学功能和可被小分子干预的蛋白相互作用界面，它成为一个有吸引力但仍需验证的 PROTAC 招募对象。
核心内容
这篇 JACS 论文的核心问题是：高选择性非共价 KEAP1 结合物是否可以从单纯的 KEAP1-NRF2 相互作用调节工具，转化为 PROTAC 中可用的 E3 招募手柄。研究团队围绕这一问题设计了双功能降解分子，将 KEAP1 结合端与 BET 蛋白结合端连接，构建概念验证分子 MS83，用于测试 KEAP1 是否能够被人工招募到 BRD 家族蛋白附近并诱导降解。
BET 蛋白是 PROTAC 研究中常用的验证对象，原因在于其小分子配体成熟、细胞检测体系相对清楚，并且已有 CRBN 招募型 BET 降解剂作为对照参照。研究中，MS83 连接 KEAP1 配体与 BRD4、BRD3、BRD2 结合端，观察其对 BET 蛋白水平的影响。结果显示，MS83 能够有效降低细胞内 BRD4 和 BRD3 蛋白水平，但对 BRD2 的降解并不明显，提示即便目标结合端覆盖同一家族成员，最终降解谱仍取决于三元复合物几何构型、蛋白表面匹配、泛素化位点可及性以及细胞背景。
这项工作并不是简单地把一个新的 E3 名字加入列表，而是把 KEAP1 的非共价结合化学、CUL3 复合体生物学和 PROTAC 诱导邻近机制连接起来。换言之，论文证明 KEAP1 不只是可以被小分子占据的蛋白相互作用节点，也可以在合适的分子构型下被改造成目标蛋白降解体系的一部分。
机制与证据
从机制上看，MS83 的活性需要同时满足几个条件：一端结合 KEAP1，另一端结合 BET 蛋白，中间连接子允许形成有效三元复合物，并且该复合物能够把目标蛋白呈递给 KEAP1 相关 E3 复合体完成泛素化。论文报告 MS83 对 BRD4 和 BRD3 的降低呈现浓度依赖和时间依赖特征，符合 PROTAC 类分子通过细胞内诱导邻近实现蛋白水平调控的基本行为。
更关键的是，研究把这种蛋白水平下降与 KEAP1 和泛素-蛋白酶体系统联系起来。若降解依赖 KEAP1 参与，并且可被蛋白酶体相关干预所影响，就说明观察到的现象更接近 E3 介导的靶向降解，而非普通抑制剂导致的表达波动或非特异性细胞毒性。对 PROTAC 研究而言，这类依赖性证据尤其重要，因为双功能分子本身可能同时带来靶点结合、E3 结合、细胞应激和物化性质变化，必须通过机制实验把真正的降解链条拆分清楚。
论文还将 KEAP1 招募型降解剂与 CRBN 招募型 BET 降解剂 dBET1 进行比较。在 MDA-MB-468 细胞中，MS83 对 BRD4 和 BRD3 的降解表现出更持久的特征；在 MDA-MB-231 细胞中，MS83 对 BRD4 短亚型相对于长亚型显示出选择性降解现象。这样的结果提示，E3 的选择并不仅仅影响“能否降解”，还可能改变降解持续时间、同源蛋白选择性、蛋白亚型选择性和细胞增殖效应。
值得注意的是，BRD2、BRD3、BRD4 同属 BET 家族，结合端对这些蛋白可能具有一定交叉结合能力，但 MS83 并未把三者等同降解。这说明 PROTAC 的选择性不只来自二元结合亲和力，三元复合物形成质量和被 E3 识别后的泛素化效率同样关键。对于药物化学读者而言，这一信息具有实际价值：开发新 E3 招募系统时，不能只考察 E3 配体的亲和力，也要系统评估连接子长度、连接位点、目标蛋白表面、亚细胞定位和细胞内有效浓度。
为什么值得关注
KEAP1 被纳入 PROTAC 招募体系，首先扩展了 E3 工具箱。CRBN 和 VHL 的成功让 PROTAC 研究快速进入可操作阶段，但也带来路径依赖。不同 E3 在组织表达、亚细胞定位、底物识别方式、复合体组成和疾病背景中的状态并不相同。新增 KEAP1 这样的招募系统，有助于研究人员比较不同 E3 在同一靶点上的降解效率、选择性和药理持续时间，也可能为难以用既有 E3 处理的靶点提供替代路径。
其次，KEAP1 的非共价招募具有方法学意义。早期一些新 E3 探索依赖共价配体或反应性天然产物片段，这类工具适合化学生物学探索，但在药物化学优化中会带来选择性、可逆性、剂量控制和安全性方面的额外问题。非共价 KEAP1 结合物若能维持高选择性和细胞活性，就更接近可迭代优化的 PROTAC 招募端，也更便于围绕亲和力、暴露量、极性、构象和连接位点进行结构-活性关系研究。
第三，这项工作把 KEAP1-NRF2 领域积累的结构与配体知识引入蛋白降解。KEAP1 的 Kelch 结构域天然识别 NRF2 上的特定结合基序，小分子可以模拟或竞争这一相互作用界面。把这类结合物转化为 PROTAC 招募端，相当于把蛋白相互作用抑制剂从“通路调节工具”改造成“诱导邻近工具”。这对许多拥有蛋白相互作用配体、但尚未被充分用于降解剂设计的靶点和 E3 具有启发意义。
对 BD 和投融资读者而言，这篇论文提供的信号是：E3 连接酶招募端本身正在成为平台能力的一部分。一个新的 E3 系统是否有价值，不只取决于能否做出单个降解剂，还取决于能否形成可复用的配体、连接子经验、细胞谱系适配规则和可解释的降解选择性。KEAP1 作为新招募系统的出现，说明 PROTAC 竞争不只是目标蛋白之争，也包括 E3 资源、结构生物学、化学生物学工具和细胞背景理解的综合竞争。
边界与待验证问题
这项研究仍应被理解为概念验证，而不是通用平台结论。论文主要围绕 BET 蛋白展开，显示 KEAP1 招募可以诱导 BRD4 和 BRD3 降解，但这并不自动意味着 KEAP1 能有效处理任意靶点。不同目标蛋白的表面赖氨酸分布、柔性、亚细胞定位、复合体状态和表达水平差异很大，都会影响 KEAP1 招募后的泛素化效率。因此，KEAP1 系统仍需在更多底物类别和更多细胞背景中扩展验证。
KEAP1 本身的生物学背景也需要谨慎处理。它参与 NRF2 稳态调控，而 NRF2 通路与氧化应激、防御反应和细胞适应密切相关。使用 KEAP1 作为 PROTAC 招募端时，必须区分 E3 招募效应与 KEAP1-NRF2 轴干扰效应，评估化合物是否会在有效浓度下显著改变 NRF2 相关转录响应。对于新 E3 招募端而言，选择性不只包括对 E3 的结合选择性，也包括对 E3 原有生物学功能的扰动程度。
药物化学层面也存在挑战。PROTAC 分子通常分子量较大、极性较高、构象自由度较多，加入 KEAP1 结合端后，分子的细胞通透性、溶解性、代谢稳定性和非特异性结合都需要重新平衡。即使某一连接子在 BET 模型中有效，也未必适合其他靶点。如何在保持 KEAP1 结合能力的同时优化整体物化性质，将决定该系统能否从化学生物学工具走向更广泛的药物发现应用。
此外，MS83 对不同 BET 家族成员和 BRD4 亚型的差异性降解虽具有启发性，但仍需要更多结构和细胞机制解释。PROTAC 选择性往往来自多因素叠加，单靠二元结合数据不足以预测最终降解谱。未来在同一日期边界内可以提出的问题包括：KEAP1 招募型三元复合物是否具有稳定可解析的构象特征，不同连接位点如何改变蛋白表面接触，KEAP1 在不同细胞系中的表达和复合体状态是否影响降解窗口，以及 NRF2 通路扰动能否与目标蛋白降解效应分离。
因此，这篇论文的准确定位应是“打开 KEAP1 作为 PROTAC E3 招募系统的入口”。它证明了高选择性非共价 KEAP1 结合物能够被用于细胞内靶向蛋白降解设计，也提示新 E3 开发不应停留在寻找配体本身，而要进一步完成底物适配、机制确证、细胞背景解析和药物化学可优化性的连续验证。