导读：2018 年 6 月 11 日，Nature Chemical Biology 在线发表 Nowak 等题为“Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation”的研究。该文以 BET 溴结构域蛋白降解为模型，系统分析 CRBN 招募型小分子降解剂如何诱导 E3 连接酶与靶蛋白形成三元复合物，并提出一个对 PROTAC 设计具有直接意义的观点：降解选择性并不能从靶点配体的二元结合谱简单外推，E3-靶蛋白界面、连接子构型、配体取向以及三元复合物的构象可塑性共同决定降解结果。
研究背景
BET 家族蛋白，尤其是 BRD2、BRD3、BRD4 等含溴结构域蛋白，是研究表观遗传调控和转录依赖性肿瘤生物学的重要靶点。以 JQ1 为代表的 BET 抑制剂通过占据乙酰化赖氨酸识别口袋阻断 BET 蛋白与染色质的相互作用，但抑制剂通常依据二元结合亲和力和选择性来评价。PROTAC 或相关异双功能降解剂则采用另一种作用逻辑：一端识别靶蛋白，一端招募 E3 泛素连接酶，通过小分子诱导靶蛋白与 E3 连接酶接近，进而触发泛素化和蛋白酶体降解。
在这类体系中，BET 配体本身可能对多个 BET 溴结构域具有相近结合能力，但降解剂在细胞中表现出的降解谱却可能明显不同。这个现象提示，靶点结合只是降解过程的起点；真正决定靶蛋白能否被有效泛素化和清除的，是降解剂诱导形成的 E3-靶蛋白复合物是否稳定、是否具有合适空间取向，以及是否能把可泛素化位点呈递给泛素转移系统。Nowak 等的工作正是围绕这一问题展开。
核心内容
该研究聚焦 CRBN 招募型 BET 降解剂。CRBN 是 CRL4CRBN E3 连接酶复合物中的底物受体，沙利度胺及其类似配体可结合 CRBN；BET 端则利用 JQ1 类识别模块结合 BRD4 等 BET 溴结构域。研究者围绕 dBET 系列化合物，比较不同连接子长度、连接位点和配体排列对 CRBN-BRD4 三元复合物形成及 BET 降解选择性的影响。
文章的中心结论是：CRBN 与 BRD4 这类原本并非天然相互作用的蛋白，在小分子降解剂诱导下可以通过多种低能量构象形成复合物。不同降解剂并不是简单地把同一对蛋白“拉近”，而是能够选择性稳定不同的蛋白-蛋白接触界面。换言之，PROTAC 的连接子和取向不仅是空间距离调节器，更是三元复合物构象选择器。
这一点解释了 BET 降解中的一个关键现象：某些化合物虽然都使用相似的 BET 识别基团和 CRBN 识别基团，但在 BRD4 第一溴结构域与第二溴结构域之间、以及 BET 家族不同成员之间表现出不同降解效率。降解活性与二元结合能力并不总是同步；同一个靶点配体在二元体系中能结合，并不保证在三元体系中能产生有利的 E3-靶蛋白界面。
机制与证据
在机制层面，研究使用了多种互补证据来描述配体诱导蛋白降解中的“结合可塑性”。首先，生化实验评估了不同 dBET 化合物诱导 CRBN 与 BRD4 溴结构域形成三元复合物的能力，并关注复合物稳定性与协同性。协同性在 PROTAC 研究中尤其重要，因为它反映的是降解剂同时结合 E3 和靶点后，两个蛋白之间是否出现有利的附加相互作用。
其次，结构研究显示，DDB1-CRBN 与 BRD4 溴结构域在 dBET23、dBET57 等化合物桥接下可形成不同空间排布。dBET23 相关结构显示，降解剂两端分别占据 CRBN 上的 IMiD 类配体结合区域和 BRD4 上的 BET 配体结合口袋，同时连接子把两个蛋白定位到特定相对取向。dBET57 等化合物则提示，即便靶点端与 E3 端识别模块相近，改变连接子和连接位置也可能使 BRD4 以不同姿态接触 CRBN，从而使用另一组蛋白表面残基。
第三，突变分析为结构观察提供了功能验证。研究者对 CRBN 或 BRD4 接触面上的关键残基进行替换，比较不同降解剂诱导三元复合物的敏感性。若两个化合物诱导的是相同界面，突变影响模式应当接近；若突变谱不同，则说明复合物接触面发生改变。该研究观察到不同 dBET 化合物具有不同的突变敏感性，支持“一个 E3-靶点组合可被不同小分子稳定在不同构象”的判断。
第四，细胞降解实验把上述生化和结构结果与蛋白水平变化联系起来。研究比较了 dBET1、dBET6、dBET23、dBET57、dBET70 等化合物对 BRD4 溴结构域相关体系的降解能力。部分化合物对 BRD4 第一溴结构域表现出较强降解活性，而对第二溴结构域的作用明显减弱；dBET57 在相关实验中体现出对 BRD4 第一溴结构域的选择性。该结果说明，BET 配体对不同溴结构域的结合相似性，并不足以解释降解选择性，三元复合物几何构型和界面性质才是更接近功能读数的层级。
此外，研究还引入计算蛋白-蛋白对接来理解 CRBN-BRD4 复合物可采用的低能量构象。计算结果与晶体结构和突变结果相互印证，提示在异双功能小分子设计中，计算模型可用于提出可能的 E3-靶蛋白接触模式，并帮助解释为什么某些连接子可以产生更强协同性或更好的降解选择性。
为什么值得关注
这项工作的重要性在于，它把 PROTAC 设计从“两个配体加一条连接子”的直观模型推进到“三元复合物工程”的层面。传统小分子优化往往围绕二元亲和力、选择性、细胞活性和理化性质展开；而降解剂需要额外回答一个问题：小分子诱导形成的 E3-靶点复合物是否具有可被泛素化系统利用的构象。
对于 BET 降解剂而言，JQ1 类 warhead 能够结合多个 BET 溴结构域，并不意味着所有 BET 蛋白都会以相同效率被降解。CRBN 招募端、BET 结合端与连接子共同塑造三元复合物表面。若 E3 与靶蛋白之间产生有利的蛋白-蛋白接触，复合物稳定性和协同性会提高，泛素化机会增加；若两者只是被勉强拉近，却缺少合适界面或几何取向，即使二元结合强，降解也可能有限。
这一认识对药物化学优化具有直接启示。第一，连接子长度并非只控制距离，还会控制旋转自由度、构象采样和界面选择。第二，warhead 的连接位点会改变靶蛋白面向 E3 的方向，进而改变可泛素化赖氨酸暴露方式。第三，E3 配体选择可能重塑选择性，因为不同 E3 连接酶具有不同表面、电荷分布和复合物构架。第四，三元复合物稳定性和协同性应当成为早期筛选的重要指标，与 DC50、最大降解幅度、时间依赖性和可逆性共同评价。
更广泛地看，该研究为“降解选择性”提供了一个可操作的解释框架。选择性不只来自靶点识别配体，也可以来自被诱导的新型蛋白-蛋白界面。对于高度同源的蛋白家族，这一点尤其关键：二元抑制剂难以区分的结构域，可能因其在三元复合物中可形成不同界面而被降解剂区分。
边界与待验证问题
需要注意的是，该研究虽然对 BET 降解选择性提供了清晰机制线索，但仍主要建立在特定靶点、特定 E3 连接酶和特定化合物系列之上。CRBN-BRD4 体系展示了结合可塑性如何带来选择性，但不同靶蛋白、不同 E3 连接酶以及不同细胞背景下，决定降解效率的因素可能并不完全相同。
另外，三元复合物形成只是降解路径中的关键步骤之一。靶蛋白能否被有效泛素化，还受赖氨酸位置、E2 酶参与、E3 复合物构象、靶蛋白亚细胞定位、蛋白周转速率、细胞通透性和化合物暴露时间等因素影响。因此，三元复合物稳定性与细胞降解之间通常存在相关性，但不能被简单视为唯一决定因素。
结构证据也有边界。晶体结构能够捕捉特定条件下的稳定构象，但细胞内复合物可能处于动态构象集合中。连接子的柔性、蛋白局部运动和瞬时接触都可能影响降解结果。对药物化学团队而言，该文更适合作为设计原则和实验框架，而不是可直接套用到所有靶点的通用公式。
尽管如此，该研究提出的核心信息足够明确：PROTAC 设计不能只追求更强靶点结合或更强 E3 配体亲和力，而应同时优化三元复合物的构象、协同性和功能性泛素化能力。对 BET 这类多结构域、高同源蛋白家族而言，这一思路为实现更精细的降解选择性提供了重要依据。
参考信息
来源：Nowak RP et al., “Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation”, Nature Chemical Biology, epub Jun 11 2018. URL：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29892083/