2024 年 1 月 4 日，Nature Communications 发表题为 DCAF1-based PROTACs with activity against clinically validated targets overcoming intrinsic- and acquired-degrader resistance 的研究论文。该工作围绕一个长期制约靶向蛋白降解领域的问题展开：尽管人类基因组编码数百种 E3 连接酶，真正被小分子 PROTAC 高效、可重复利用的 E3 仍主要集中在 CRBN 和 VHL。E3 工具箱过窄，不仅限制了可降解靶点范围，也使降解剂项目面对由 E3 表达缺失、突变或通路适应引起的耐药风险时缺少替代方案。
这项研究的核心贡献，是将 DCAF1 这一 CRL4 复合物相关的 E3 受体转化为可用于 PROTAC 设计的非共价 E3 招募端。作者基于选择性 DCAF1 WDR 结构域结合物，构建了多个 DCAF1-based PROTAC 原型，并在 BRD9、多个酪氨酸激酶以及 BTK 模型中验证其降解活性。更值得关注的是，论文不仅停留在“能否降解”的概念验证，而是进一步测试了 DCAF1 PROTAC 在 VHL 缺失或 CRBN PROTAC 耐药背景下是否仍能发挥作用。
事件背景：E3 多样性仍是 TPD 转化的关键瓶颈
PROTAC 的药理学基础是诱导靶蛋白与 E3 连接酶形成近邻复合物，使靶蛋白被泛素化并经蛋白酶体降解。与传统抑制剂相比，降解剂可以清除蛋白本身，理论上可覆盖催化活性以外的支架功能、转录调控功能或蛋白复合体功能。但在实际药物发现中，E3 端的选择明显少于靶点端。CRBN 和 VHL 拥有成熟配体、丰富经验和大量可复用化学骨架，因此成为当前 PROTAC 项目的主力 E3；相应地，行业也逐渐意识到，过度依赖少数 E3 可能带来机制同质化和耐药脆弱性。
CRBN 的例子尤其具有启发性。免疫调节药物以及一系列 CRBN-based 降解剂依赖 CRBN 介导新底物降解，而 CRBN 表达降低或相关通路改变可能削弱药效。对于 PROTAC 而言，如果肿瘤细胞通过下调某一 E3、改变 E3 复合物组装或影响泛素化机器逃逸降解压力，那么单一 E3 依赖就可能成为项目风险。因此，开发新的 E3 招募端，不只是化学工具拓展，也与未来降解剂耐药管理、组合设计和患者分层有关。
DCAF1 又称 VprBP，是 CRL4 复合物中的底物受体之一，含有 WD40 重复结构域。论文选择 DCAF1 的理由包括：其属于 WDR 蛋白家族中具有潜在可配体化口袋的成员；其作为 CRL4 复合物受体，与 DDB1、CUL4A/B 等泛素化机器相关；并且作者从细胞依赖性角度提出，DCAF1 的必需性可能使通过单纯丢失 E3 表达获得耐药的门槛高于非必需 E3。这个假设需要更多药物化和疾病模型验证，但为 DCAF1 作为替代 E3 提供了清晰生物学动机。
核心进展：非共价 DCAF1 配体被转化为多类 PROTAC
论文首先对 DCAF1 小分子结合物进行了表征。作者使用的代表性 DCAF1 binder 可结合 DCAF1 WDR 结构域，SPR 与 TR-FRET 数据显示其亲和力达到双位数纳摩尔范围；相应的阴性对照化合物通过关键位点改造显著削弱 DCAF1 结合。这个设计很重要，因为对新 E3 来说，证明降解确实依赖目标 E3，而不是由靶点配体、细胞毒性或非特异蛋白稳态扰动造成，是判断工具价值的前提。
在第一个原型中，作者将 DCAF1 结合物与 BRD9 配体连接，得到 DCAF1-BRD9 PROTAC DBr-1。BRD9 是降解剂领域常用的验证靶点之一，已有 VHL-based 与 CRBN-based BRD9 PROTAC 可作为参照。DBr-1 在 HEK293 相关模型中诱导 BRD9 快速下降，在 1 μM 处理 6 小时后观察到约 90% 的 BRD9 蛋白损失；在 HiBiT 系统中，DBr-1 对 BRD9 的 DC50 约为 90 nM，而对同源蛋白 BRD7 的影响较弱。与 VZ185 和 dBRD9 的比较显示，DCAF1 并非只能产生低效原型，而能够在合适三元复合物条件下实现与成熟 E3 系统相近的降解水平。
机制验证方面，DBr-1 介导的 BRD9 降解可被泛素活化、NEDD8 活化和蛋白酶体抑制剂挽救，提示其依赖泛素-蛋白酶体系统和 CRL 活性。作者还通过 DCAF1 相关 sgRNA、泛素通路亚库筛选以及 CRL4 复合物关键组分验证，进一步支持 DBr-1 的作用路径为 CRL4-DCAF1 介导的蛋白酶体降解。这些遗传和化学挽救实验提高了结论可信度，也为后续使用 DCAF1 作为 E3 锚点建立了较完整的药理学证据链。
在第二类原型中，研究团队将 DCAF1 招募端与 dasatinib 连接，构建 DCAF1-dasatinib PROTAC DDa-1，以探索 DCAF1 是否可降解溴结构域以外、并且位于不同亚细胞区域的蛋白。结果显示，DDa-1 在 HEK293T 细胞中可降低 CSK 和 LIMK2 等酪氨酸激酶水平，蛋白质组学还观察到 TEC 和 TNK2 下降。由于 dasatinib 靶谱较广，这一实验并不等同于选择性候选药物发现，但它说明 DCAF1 PROTAC 不局限于核内 BRD9，也可触达部分细胞质或膜相关激酶靶点。
临床相关靶点与耐药模型：BTK 是最值得关注的验证场景
论文进一步聚焦 BTK，这是血液肿瘤中高度临床验证的激酶靶点，也是 PROTAC 领域已有较多布局的对象。作者先用 DDa-1 在 BTK 表达的 TMD8 弥漫大 B 细胞淋巴瘤细胞中确认 BTK 可被 DCAF1-based PROTAC 降解，随后开发更具 BTK 指向性的 DCAF1-BTK PROTAC，包括 DBt-5 与 DBt-10。两者均可在工程化 TMD8 BTK-GFP/mCherry 系统中降解 BTK，但 DBt-10 在综合三元复合物稳定性、体外泛素化速率和细胞毒性窗口后被选为重点化合物。
DBt-10 的数据呈现出一个有代表性的 PROTAC 优化权衡：它的细胞渗透性并非最优，但三元复合物表现更有利，且在细胞中仍能实现有效 BTK 降解。作者在 TMD8 细胞中观察到内源性 BTK 在约 6 小时时出现明显下降，2.5 μM 浓度下可见显著降解；该过程可被蛋白酶体抑制、NEDD8 通路抑制和泛素活化抑制条件挽救，也可被 DCAF1 或 BTK 相关配体竞争性削弱。蛋白质组学分析显示，BTK 是 DBt-10 处理后下降最显著的蛋白之一，LIMK1 是另一个显著下降蛋白，提示该分子具备一定选择性，但仍需进一步优化脱靶谱和药物样性质。
耐药验证是这篇论文的重点。对于先天性 E3 缺失，作者使用 VHL 缺失的 768-O 细胞测试 BRD9 降解。在该模型中，VHL-based BRD9 PROTAC 活性受限，而 DCAF1-based DBr-1 与 CRBN-based dBRD9 仍可降解 BRD9，支持 DCAF1 可作为 VHL 不适用背景下的替代 E3。对于获得性耐药，作者通过长期暴露 CRBN-BTK PROTAC 建立 TMD8 耐药模型；在该模型中，CRBN-BTK PROTAC 对 BTK 降解失效，与 CRBN 表达丢失一致，而 DCAF1-BTK PROTAC DBt-10 仍能实现相近水平的 BTK 降解，并在细胞增殖实验中未显示与 CRBN 状态相关的明显效力差异。
这一部分的行业意义在于，它把“换 E3 克服降解剂耐药”从概念推进到具体细胞模型。对于临床验证靶点 BTK，如果 CRBN 相关降解剂在某些背景下遭遇 E3 端耐药，那么 DCAF1 这类替代 E3 招募端可能提供后续分子设计路径。当然，这仍是临床前细胞模型结果，不能直接外推到患者疗效；但作为机制验证，它提示 TPD 项目在早期就应考虑 E3 多样性、耐药诱导实验和备用 E3 策略。
技术意义、风险与后续观察点
从技术角度看，该研究最重要的价值不是某一个具体分子的即刻成药性，而是证明了内源表达水平下的 DCAF1 可被非共价小分子招募，并能驱动多个靶蛋白降解。此前针对新 E3 的探索常受到几个问题限制：配体亲和力不足、细胞内占有率有限、只能在过表达条件下工作、缺乏强机制挽救数据，或降解窗口与细胞毒性难以区分。本文通过 DCAF1 binder、阴性对照、BRD9/BTK 两类靶点、化学和遗传挽救、蛋白质组学以及耐药模型，提供了相对系统的验证框架。
对药物化学而言，DCAF1 提供了一个新的 E3 端设计变量。不同 E3 对靶蛋白表面、空间取向、亚细胞定位和三元复合物动力学的偏好不同，因此同一个靶点在 CRBN、VHL、DCAF1 或其他 E3 下可能产生不同选择性和降解深度。本文中 DBr-1 对 BRD9/BRD7 的区分、DBt-10 与 DBt-5 在三元复合物稳定性和细胞通透性之间的差异，都再次说明 PROTAC 优化不能只看二元结合亲和力，而需要同时整合 linker 几何、复合物协同性、泛素化效率、细胞暴露和目标组织 E3 表达。
但风险也同样明确。第一，DCAF1 是细胞内重要 CRL4 受体，具有内源底物和复杂生物学功能。招募 DCAF1 进行异源底物降解，是否会竞争天然底物识别、扰动 DCAF1-DDB1-CUL4 复合物稳态，仍需系统评估。第二，论文中部分 DCAF1 结合物或 PROTAC 在较高浓度下出现细胞活性窗口问题，提示该 E3 端化学系列仍需改善选择性、通透性和安全边界。第三，DBt-10 的细胞渗透性并不理想，BTK 降解浓度仍有优化空间；对于口服小分子降解剂而言，分子量、极性、暴露和组织分布将是进入更高阶模型前必须面对的挑战。
第四，耐药模型仍主要来自细胞水平。CRBN 丢失背景下 DCAF1-BTK PROTAC 保留活性，是强有力的机制证据，但真实肿瘤中耐药往往包含靶点突变、通路重塑、药物外排、细胞状态改变和微环境因素。DCAF1 是否真能在体内延缓或克服降解剂耐药，需要在更复杂模型中验证。此外，DCAF1 自身虽然可能具有较高依赖性，但这并不等于不会发生功能性耐药；细胞仍可能通过靶蛋白端、泛素化通路或蛋白酶体压力适应产生逃逸。
后续值得观察的方向包括：DCAF1 配体是否能进一步优化为更适合药物发现的 E3 handle；不同靶点与 DCAF1 之间是否存在可预测的降解适配规则；DCAF1 PROTAC 在原代细胞、异种移植或患者来源模型中是否保留选择性和安全窗口；以及它能否与 CRBN、VHL 或其他 E3 招募策略形成真正可执行的耐药管理组合。对于 TPD 行业而言，这篇论文提供的信号是清晰的：E3 多样化正在从“发现新配体”的化学问题，逐渐变成决定降解剂适应症选择、耐药策略和临床可持续性的系统问题。
参考信息：Schröder 等，Nature Communications，2024 年 1 月 4 日，DCAF1-based PROTACs with activity against clinically validated targets overcoming intrinsic- and acquired-degrader resistance。